Cryo-SEM Mikrographien der verwendeten Mikroemulsion

Im Gegensatz zu den normalerweise als Emulsionen bekannten Markoemulsionen weisen Mikroemulsionen ein sehr kleine Domänengröße (Tröpfchengröße) auf, die in der Regel < 350 nm ist. Daher streuen Mirkoemulsionen das Licht nicht und erscheinen daher als klare homogene Flüssigkeiten. Desweiteren sind Mikroemulsionen thermodynamisch stabil, d.h. sie entmischen sich nicht spontan, ein Vorgang der bei Makroemulsionen in der technischen Anwendung ein Problem darstellt. In sog. bikontinuierlichen Mikroemulsionen, die Gegenstand der hier besprochenen Arbeit sind, zeigt sich als Besonderheit, dass es nicht zur Ausbildung von Micellen in Tröpchenform in einer kontinuierlichen Phase kommt (wie in klassischen Öl in Wasser oder Wass in Öl Emulsionen), sondern das sowohl die Wasser- als auch die Ölphase jeweils als kontinuierliche Phase vorliegen, wobei sich eine schwammartige Struktur ausbildet(siehe Abbildung). Solche bikontinuierlichen Mikroemulsionen sind als Trägermatrix für Dekontaminationsmittel von großem Interesse, da sie hydrophobe Kampfstoffe wie z.B. VX effektiv lösen und es aufgrund der sehr großen inneren Grenzfläche zu effektiven Transportprozessen in die wässrige Phase kommt, wo hydrophile reaktive Bestandteile wie z.B. Oximatanionen oder Enzyme zu einer chemischen Umsetzung und Entgiftung des Kampfstoffs führen.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mikroemulsion eingesetzt, die als Emulgator Zuckertenside enthält. Diese zeichnen sich durch gute Eigenschaften als Lösungsvermittler aus und sind darüber hinaus gut biologisch abbaubar und auch verträglich auf der menschlichen Haut. Als reaktive Komponente kam das Enzym Diisopropyl Fluorophosphatase (DFPase) zum Einsatz, das Kampfstoffe der G-Reihe wie Sarin und Soman effektiv durch Hydrolyse entgiftet. Die Struktur der Mikroemulsion, bei der Cyclohexan als Ölphase dient, wurde mit Hilfe einer Reihe von Beugungsexperimenten untersucht, darunter Dynamic Light Scattering (DLS), Small Angle Neutron Scattering (SANS) und Neutronen Spin-Echo (NSE) Spektroskopie. Darüber hinaus wurden die Eigenschaften von DFPase in wässriger Pufferlösung untersucht. Hier wurde ein hydrodynamischer Radius von R=2,34 nm bestimmt, was zusammen mit dem Diffusionkoeffizienten in sehr guter Übereinstimmung mit den Vorhersagen war und die globuläre Form des Enzyms bestätigte, wie sie mit Hilfe von Röntgenbeugungs bereits bestimmt wurde. Die untersuchte Mikroemulsion wies eine Domänengröße von 15-16 nm auf. Die Zugabe des Enzyms veränderte die Struktur der Emulsion nicht und die DFPase ist ausschließlich, wie zu erwarten, in der wässrigen Phase lokalisiert.

Die Aktivität des Enzyms wurde mit Hilfe von 1D 1H–31P HSQC NMR Spektroskopie bestimmt. Der pH der wässrigen Phase hatte hierbei einen Wert von 7,5. Hier zeigt sich mit dem Kampfstoff Sarin (GB) als Substrat eine etwa um die Hälfte verminderte Aktivität im Vergleich zur wässrigen Lösung. Dies kann leicht durch Erhöhung der Enzymmenge ausgeglichen werden. Zur Erklärung für diese Verminderte Aktivität muss berücksichtigt werden, dass das Substrat zum Teil in der Ölphase gelöst ist und die effektive Substratkonzentration für das Enzym daher niedriger ist. Hinzu kommen komplexe Interaktionen zwischen chemischem Abbau in der Wasserphase und Transportprozessen über die Phasengrenzfläche aus der Ölphase heraus. Die Aktivitätsmessungen wurden am Bundeswehr Institut für Pharmakologie und Toxikologie in München und die Neutronenexperimente wurden an der Neutronenquelle in Saclay, Frankreich und am FRM-II in München durchgeführt.

The DFPase from Loligo vulgaris in sugar surfactant-based bicontinuous microemulsions: structure, dynamics, and enzyme activity.
Wellert S, Tiersch B, Koetz J, Richardt A, Lapp A, Holderer O, Gäb J, Blum MM, Schulreich C, Stehle R, Hellweg T.
Eur. Biophys. J. 2011; 40(6):761-74.
http://dx.doi.org/10.1007/s00249-011-0689-0

Abstract:
The enzyme diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from the squid Loligo vulgaris is of great interest because of its ability to catalyze the hydrolysis of highly toxic organophosphates. In this work, the enzyme structure in solution (native state) was studied by use of different scattering methods. The results are compared with those from hydrodynamic model calculations based on the DFPase crystal structure. Bicontinuous microemulsions made of sugar surfactants are discussed as host systems for the DFPase. The microemulsion remains stable in the presence of the enzyme, which is shown by means of scattering experiments. Moreover, activity assays reveal that the DFPase still has high activity in this complex reaction medium. To complement the scattering experiments cryo-SEM was also employed to study the microemulsion structure.

Adduktbildung in Phosphatpuffer (hier mit GF)

Wir haben kürzlich über die Bildung von stabilen Addukten von Nervenkampfstoffen der G-Reihe wie Sarin, Soman und Cyclosarin mit Puffersubstanzen berichtet, die wie z.B. TRIS, TES oder HEPES Aminoalkohole sind. Die Bildung der hydrolysestabilen Phosphodiester-Addukte hängt dabei sowohl von der Konzentration des Kampfstoffs als auch der Konzentration der Puffersubstanz ab. Wir haben empfohlen für analytische Arbeiten auf diese Puffer zu verzichten und statt dessen auf Substanzen wie MES, MOPS oder CHES zurückzugreifen, die keine Addukte bilden.

Eine weitere in der biologischen, biochemischen und medizinischen Forschung weit verbreitete Puffersubstanz ist anorganisches Phosphat und zwar insbesondere dort, wo der pH auf den physiologischen Wert von 7.4 gepuffert werden soll. Uns interessierte, ob die bei diesem pH vorliegenden Phosphatspezies als Nukleophile mit G-Kampfstoffen reagieren können und mit diesen ebenfalls Addukte bilden. Dies ist in der Tat der Fall. Wir konnten zeigen, dass die Kampfstoffe in Phosphatpuffer deutlich schneller hydrolysieren, als z.B. in MOPS Puffer bei gleichem pH. Darüber hinaus konnten wir auch die Bildung signifikanter Mengen von pyrophosphat-ähnlichen Addukten (phosphorylierte Methylphosphonate) feststellen. Diese hydrolysieren langsam, wobei eine Kinetik pseudo-nullter Ordnung zu beobachten ist. Dies führt zu einem komplexen Gemisch von phosphorhaltigen Verbindungen mit zeitlich wechselnden Konzentrationen. Die molekulare Struktur dieser Addukte konnte durch 1D 1H–31P HSQC NMR and LC–ESI-MS/MS Techniken aufgeklärt werden. Die Reaktionsgeschwindigkeit der Adduktbildung ist vergleichbar mit der Geschwindigkeit der Hydrolyse zum primären Hydrolyseprodukt und führt zur Bildung signifikanter Mengen des Addukts innerhalb von wenigen Minuten.

Als aktives Nukleophil postulieren wir das Hydrogenphosphatanion. Die andere bei diesem pH vorliegende Spezies, das Dihydrogenphosphat ist weniger nukleophil. Die beobachtete Hydrolysekinetik pseudo-nullter Ordnung des Addukts kann damit erklärt werden, dass nur ein sehr kleiner Teil bei pH 7.4 als neutrale Verbindung vorliegt, während die anionischen Spezies vor Hydrolyse geschützt sind (wie z.B. Phosphodiester) und in deutlichem Überschuss vorliegen. Dies führt dazu, dass die Konzentration der reaktiven neutralen Verbindung über lange Zeit konstant bleibt und so eine Kinetik nullter Ordnung beobachtet wird. Für den Fall der Prallelreaktion, die zum primären Hydrolyseprodukt führt, nehmen wir an, dass das Hydrogenphosphatdianion als Base wirkt und diese Reaktion basenkatalysiert verläuft, was zu einer Reaktionsbeschleunigung im Vergleich zur Reaktion bei gleichem pH in MOPS-Puffer führt.

Formation of pyrophosphate-like adducts from nerve agents sarin, soman and cyclosarin in phosphate buffer: Implications for analytical and toxicological investigations.
Gäb J, John H, Blum MM.
Toxicol. Lett. 2011; 200(1):34-40.
http://dx.doi.org/10.1016/j.toxlet.2010.10.011

Abstract:
Phosphate buffer is frequently used in biological, biochemical and biomedical applications especially when pH is to be controlled around the physiological value of 7.4. One of the prerequisites of a buffer compound among good buffering capacity and pH stability over time is its non-reactivity with other con- stituents of the solution. This is especially important for quantitative analytical or toxicological assays. Previous work has identified a number of amino alcohol buffers like TRIS to react with G-type nerve agents sarin, soman and cyclosarin to form stable phosphonic diesters. In case of phosphate buffer we were able to confirm not only the rapid hydrolysis of these agents to the respective alkyl methylphosphonates but also the formation of substantial amounts of pyrophosphate-like adducts (phosphorylated methylphos- phonates), which very slowly hydrolyzed following zero-order kinetics. This led to a complex mixture of phosphorus containing species with changing concentrations over time. We identified the molecular structure of these buffer adducts using 1D 1H–31P HSQC NMR and LC–ESI-MS/MS techniques. Reaction rates of adduct formation are fast enough to compete with hydrolysis in aqueous solution and to yield substantial amounts of buffer adduct over the course of just a couple of minutes. Possible reaction mechanisms are discussed with respect to the formation and subsequent hydrolysis of the pyrophosphate-like compounds as well as the increased rate of hydrolysis of the nerve agent to the corresponding alkyl methylphosphonates. In summary, the use of phosphate buffer for the development of new assays with sarin, soman and cyclosarin is discouraged. Already existing protocols should be carefully reexamined on an individual basis.

Diskutierte Reaktionsmechanismen der DFPase

Kenntnisse über den Reaktionsmechanismus des Enzyms DFPase sind von entscheidender Bedeutung für Erfolgsaussichten von gerichtetem Proteindesign, denn dieser gibt die Orientierung von Substraten in der Bindungstasche des Enzyms für die erfolgreiche Umsetzung zum Produkt vor. Darüber können für den Mechanismus wichtige Aminosäuren gezielt optimiert werden. Im Fall der DFPase wurden in der Vergangenheit drei verschiedene Mechanismen diskutiert.

Als im Jahr 2001 die erste Röntgenbeugungsstruktur des Enzyms publiziert wurde (Scharff et al., Structure 9 (2001) 493-502), fand man den Histidinrest H287 der Teil der Bindungstasche war. Die Mutation H287N zeigte nur minimale enzymatische Aktivität. Daher wurde postuliert, dass H287 ein Wassermolekül aktiviert, das wiederum das über den Phosphorylsauerstoff and das Calciumion koordinierte Substratmolekül am Phosphoratom nukleophil angreift (oberstes Schema in der Abbildung). Da Mutationen wie H287F jedoch enzymatisch Aktiv sind musste dieser Mechanismus verworfen werden.

Alternativ wurde vorgeschlagen, dass das Calciumion in der katalytischen Bindungstasche der DFPase direkt ein koordiniertes Wasser aktiviert (und dieses als Hydroxidion vorliegt). Dieses Hydroxidion soll dann als Nukleophil das Phosphoratom des ebenfalls an das Calciumion koordinierten Substratmoleküls angreifen (mittleres Schema in der Abbildung). Dieser Mechanismus konnte durch die Neutronenbeugungsstruktur der DFPase wiederlegt werden, in der eindeutig das entsprechende koordinierte Wasser als Wassermolekül und nicht als Hydroxidion vorliegt. Wichtig ist in diesem Zusammenhang der Hinweis, dass die Neutronendaten (und entsprechende Röntgendaten für das “Joint Refinement”) bei Raumtemperatur aufgenommen wurden, also bei der für die katalytische Aktivität relevanten Temperatur. Die Neutronenstruktur ist allerdings im Einklang mit einem dritten Mechanismus, der auf der Grundlage von Isotopenmarkierung, Mutationsstudien und der Struktur eines Inhibitorkomplexes vorgeschlagen wurde.

Sonderband von Acta D

Dieser Mechanismus (Blum et al., JACS 128 (2006) 12750-12757) identifiziert den calciumkoordinierenden Rest D229 als das angreifende Nukleophil. Als Intermediat wird dabei ein energiereiches und instabiles Phosphoenzymintemediat gebildet, das wiederum durch Wasser hydrolysiert wird, wobei das Enzym regeneriert und das Produkt freigesetzt wird (unterstes Schema in der Abbildung).

Die Ergebnisse der Neutronenbeugungsstruktur der DFPase sowie von Mutations- und Kinetikstudien haben wir nun in einer Veröffentlichung im Journal Acta Cryst. D zueinander in Beziehung gesetzt. Der Artikel ist Teil eines Sonderbandes mit dem Titel “Neutrons in Biology“. Obwohl alle Artikel des Bandes lesenswert sind und einen tieferen Einblick in den aktuellen Stand der Forschung mit Neutronen an Biomakromolekülen erlauben, sei doch ein Artikel besonders zur Lektüre empfohlen: Benno P. Schoenborn, der Ende der 60er Jahre die erste Neutronenstruktur von Myoglobin publizierte (und damit die erst Neutronenstruktur eines Proteins überhaupt), bietet in seinem Artikel mit dem Titel “A history of neutrons in biology: the development of neutron protein crystallography at BNL and LANL” einen faszinierenden Überblick über die mittlerweile mehr als vierzigjährige Geschichte von Neutronen in der biologischen Forschung.

Neutron structure and mechanistic studies of diisopropyl fluorophosphatase (DFPase).
Blum MM, Tomanicek S, John H, Hanson L, Rüterjans H, Schoenborn BP, Langan P, Chen JC.
Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010; 66(11):1131-1138.
http://dx.doi.org/10.1107/S0907444910034013

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Abstract:
Diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) is a calcium-dependent phosphotriesterase that acts on a variety of highly toxic organophosphorus compounds that act as inhibitors of acetylcholinesterase. The mechanism of DFPase has been probed using a variety of methods, including isotopic labelling, which demonstrated the presence of a phosphoenzyme intermediate in the reaction mechanism. In order to further elucidate the mechanism of DFPase and to ascertain the protonation states of the residues and solvent molecules in the active site, the neutron structure of DFPase was solved at 2.2 Å resolution. The proposed nucleophile Asp229 is deprotonated, while the active-site solvent molecule W33 was identified as water and not hydroxide. These data support a mechanism involving direct nucleophilic attack by Asp229 on the substrate and rule out a mechanism involving metal-assisted water activation. These data also allowed for the re-engineering of DFPase through rational design to bind and productively orient the more toxic S stereoisomers of the nerve agents sarin and cyclosarin, creating a modified enzyme with enhanced overall activity and significantly increased detoxification properties.

Plot der RMSD Werte für C-α Kohlenstoffatome zwischen d-DFPase und h-DFPase

Neutronenbeugungsstrukturen von Proteinen haben in Vergleich zu Röntgenstrukturen den großen Vorteil, dass in ihnen auch Wasserstoffatome sichtbar gemacht werden. Dies ermöglicht Aussagen über Protonierungszustände von Aminosäureseitenketten sowie über die Ausrichtung einzelner Solvensmoleküle. Dies ist insbesondere zur Aufklärung von Enzymmechanismen von großer Bedeutung. Der Nachteil der Neutronenbeugung liegt in der geringen Anzahl geeigneter Instrumente weltweit und Ihrem (im Vergleich zu Röntgenquellen) kleinen Neutronenfluss. Daher werden sehr große Proteinkristalle benötigt und die Zeiten für die Ausnahme eines Datensatzes können leicht bei mehreren Wochen liegen. Ein weiteres Problem ist das Signal-Rausch-Verhältnis bei der Datenaufnahme. Hier sind insbesondere die Wasserstoffatome im Kristall problematisch, da Wasserstoff einen großen inkohärenten Streuquerschnitt aufweist. Dieser Streuquerschnitt, der bei hohen Werten zu diffuser Streuung führt, ist beim Wasserstoffisotop Deuterium deutlich geringer (2.05 b für Deuterium verglichen mit 80.27 b für normalen Wasserstoff; 1 b = 100 fm²). Daher wird bei Neutronenexperimenten der zu vermessende Kristall gewöhnlich mit deuterierter Mutterlauge in Kontakt gebracht (in der Regel über Diffusion über die Gasphase). Hierbei tauschen die labilen Wasserstoffatome (z.B. die des Solvens und Wasserstoff an sauren bzw. basischen Seitenketten) gegen Deuterium aus. Nichtlabile Wasserstoffatome, wie sie z.B. in aliphatischen oder aromatischen C-H Bindungen auftreten, tauschen hingegen nicht aus. Daher verbleibt ein gewisser Anteil an Wasserstoff im Protein ohne Austausch.

Cover von Acta F mit DFPase

Ein solcher partiell ausgetauschter Kristall wurde für die bereits publizierte Neutronenstruktur der DFPase verwendet.

Um eine vollständige Deuterierung des Proteins zu erreichen, muss dieses in volldeuteriertem Medium exprimiert werden. Über die Röntgenbeugungsstruktur von perdeuterierter DFPase berichten wir nun in einer neuen Veröffentlichung im Journal Acta Cryst. F. Die Struktur (bei Raumtemperatur in einer Auflösung von 2.1 Å gelöst) zeigt, dass die vollständige Deuterierung zu praktisch keinen Veränderungen in der Proteinstruktur führt. Doch obwohl ein großer Kristall gezüchtet werden konnte (> 2mm³), beugte dieser im Neutronenexperiment praktisch gar nicht. Eine Erklärung für dieses erstaunliche Resultat kann in der Datenaufnahme (Querschnitt des Neutronenstrahls im Vergleich zum Röntgenstrahl) liegen. Ein weiter Erklärungsversuch zielt auf kristallographische Parameter ab. Die Beugungscharakteristiken von erfolgreichen Neutronenbeugungsexperimenten und den dazu gehörigen Röntgendaten werden tabelliert dargestellt und geben einen Anhalt für zukünftige Neutronenexperimente.

X-ray structure of perdeuterated diisopropyl fluorophosphatase (DFPase): Perdeuteration of proteins for neutron diffraction.
Blum MM, Tomanicek S, John H, Hanson L, Rüterjans H, Schoenborn BP, Langan P, Chen JC.
Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 2010; 66(4):379-385.
http://dx.doi.org/10.1107/S1744309110004318

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Abstract:
The signal-to-noise ratio is one of the limiting factors in neutron macromolecular crystallography. Protein perdeuteration, which replaces all H atoms with deuterium, is a method of improving the signal-to-noise ratio of neutron crystallography experiments by reducing the incoherent scattering of the hydrogen isotope. Detailed analyses of perdeuterated and hydrogenated structures are necessary in order to evaluate the utility of perdeuterated crystals for neutron diffraction studies. The room-temperature X-ray structure of perdeuterated diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) is reported at 2.1 Å resolution. Comparison with an independently refined hydrogenated room-temperature structure of DFPase revealed no major systematic differences, although the crystals of perdeuterated DFPase did not diffract neutrons. The lack of diffraction is examined with respect to data-collection and crystallographic parameters. The diffraction characteristics of successful neutron structure determinations are presented as a guideline for future neutron diffraction studies of macromolecules. X-ray diffraction to beyond 2.0 Å resolution appears to be a strong predictor of successful neutron structures.

Katalytische Ca-Bindungsstelle der DFPase

Das Enzym DFPase ist strukturell sehr gut beschrieben. Es ist sowohl eine Röntgenstruktur in atomarer Auflösung, als auch eine Neutronenstruktur verfügbar. Daneben wurde eine ganze Reihe von Mutanten der DFPase erzeugt, von denen einige auch per Röntgenbeugung strukturell untersucht werden konnten. Was bisher fehlte war eine systematische Betrachtung der katalytischen Calciumbindungsstelle der DFPase in Bezug auf katalytische Aktivität und der Fähigkeit zur Metallbindung. Eine Zusammenfassung bereits bekannter Daten, sowie drei neue Kristallstrukturen von Mutanten die Reste der Metallbindungsstelle verändern wurden nun in einem Artikel im Journal Chemico-Biological Interactions veröffentlicht. Hieraus konnten Regeln für Aktivität und Metallbindung abgeleitet werden.

Ein Vergleich mit den strukturell ähnlichen Proteinen Paraoxonase (PON1), Drug Resistance Protein 35 (Drp35) aus S. aureus oder der Gluconolactonase XC5397 aus Xanthomonas campestris zeigt Calciumbindungstellen mit fast identischer Topologie, zum Teil aber unterschiedlichen enzymatischen Aktivitäten (PON1 ist auch ein Phosphotriesterase aber die nativen Substrate von PON1, Drp35 und XC5397 scheinen Laktone zu sein). Die mögliche Übertragbarkeit der für die DFPase gefunden Regeln auf die anderen Proteine wird diskutiert.

Structural characterization of the catalytic calcium binding site in diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) and comparison with related β-propeller enzymes.
Blum MM, Chen JC.
Chem. Biol. Interact. 2010; 187(1-3):373-379.
http://dx.doi.org/10.1016/j.cbi.2010.02.043

Abstract:
The calcium-dependent phosphotriesterase diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from the squid Loligo vulgaris efficiently hydrolyzes a wide range of organophosphorus nerve agents. The two calcium ions within DFPase play essential roles for its function. The lower affinity calcium ion located at the bottom of the active site participates in the reaction mechanism, while the high affinity calcium in the center of the protein maintains structural integrity of the enzyme. The activity and structures of three DFPase variants targeting the catalytic calcium-binding site are reported (D121E, N120D/N175D/D229N, and E21Q/N120D/N175D/D229N), and the effect of these mutations on the overall structural dynamics of DFPase is examined using molecular dynamics simulations. While D229 is crucial for enzymatic activity, E21 is essential for calcium binding. Although at least two negatively charged side chains are required for calcium binding, the addition of a third charge significantly lowers the activity. Furthermore, the arrangement of these charges in the binding site is important for enzymatic activity. These results, together with earlier mutational, structural, and kinetic studies, show a highly evolved calcium-binding environment, with a specific electrostatic topology crucial for activity. A number of structural homologues of DFPase have been recently identified, including a chimeric variant of Paraoxonase 1 (PON1), drug resistance protein 35 (Drp35) from Staphylococcus aureus and the gluconolactonase XC5397 from Xanthomonas campestris. Surprisingly, despite low sequence identity, these proteins share remarkably similar calcium-binding environments to DFPase.

Mechanismus der Adduktbildung

Puffersubstanzen dienen der Aufrechterhaltung eines bestimmten pH-Werts in Lösung. Neben der Pufferkapazität und der pH-Stabilität über längere Zeit ist ein weiter wichtiger Faktor bei der Auswahl einer Puffersubstanz ihre Nicht-Reaktivität mit anderen Komponenten der Lösung. In einer neuen Veröffentlichung in der Zeitschrift Journal of Chrmatography B berichten wir über die Bildung von stabilen Addukten von Nervenkampfstoffen wie Sarin, Soman oder Cyclosarin mit im Labor üblichen Puffersubstanzen wie TRIS, TES oder HEPES. Die Reaktion verläuft in Konkurrenz zur spontanen Hydrolyse der Nervenkampfstoffe und kann zu Ausbeuten von bis zu über 40% in Bezug auf das vorhandene Organophosphat/phosponat führen.

Bei der Verwendung einer kürzlich von uns vorgestellten NMR-Methode zur Verfolgung des Abbaus von Nervenkampfstoffen mit Enzymen in gepufferter Lösung beobachteten wir das Entstehen einer neuen, phosphorhaltigen und hydrolysestabilen Verbindung. Mit Hilfe von LC-ESI-MS/MS Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass es sich um Addukte zwischen Puffer und Nervenkampfstoff handelt. Nun können Puffersubstanzen wie TES oder TRIS sowohl als Stickstoffnukleophile (über die Aminogruppe) als auch als Sauerstoffnukleophile (über die Sauerstoffatome der Hydroxylgruppen) wirken. Die Identifizierung der Pufferaddukte als Phosphordiester (“O-Addukte”) gelang wiederum mittels NMR-Spektroskopie.

Als möglichen Reaktionsmechanismus schlagen wir vor, dass die Aminogruppe des Puffers als intramolekularer Protonenakzeptor fungiert, der ein Proton von einer der Hydroxylgruppen des Puffers aufnehmen kann. Hierdurch erhöht sich die Nukleophilie dieses Sauerstoffatoms, dass das Phosphoratom des Kampfstoffs angreift und zur Bildung eines Phosphodiesters (im Fall der Organophosphonate wie Sarin, Soman und Cyclosarin) führt. Als alternative Puffersubstanzen für die Arbeit mit Nervenkampfstoffen schlagen wir Substanzen wie MOPS (pK = 7,2), CHES (pK = 9,3) und MES (pK = 6,15) vor. Diese weisen keine Kombination von Amino- und Hydroxylgruppen auf und zeigten im Experiment keine Adduktbildung.

Stable adducts of nerve agents sarin, soman and cyclosarin with TRIS, TES and related buffer compounds–Characterization by LC-ESI-MS/MS and NMR and implications for analytical chemistry.
Gäb J, John H, Melzer M, Blum MM.
J. Chromatogr. B 2010; 878(17-18):1382-1390.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2010.01.043

Abstract:
Buffering compounds like TRIS are frequently used in chemical, biochemical and biomedical applications to control pH in solution. One of the prerequisites of a buffer compound, in addition to sufficient buffering capacity and pH stability over time, is its non-reactivity with other constituents of the solution. This is especially important in the field of analytical chemistry where analytes are to be determined quantitatively. Investigating the enzymatic hydrolysis of G-type nerve agents sarin, soman and cyclosarin in buffered solution we have identified stable buffer adducts of TRIS, TES and other buffer compounds with the nerve agents. We identified the molecular structure of these adducts as phosphonic diesters using 1D 1H-31P HSQC NMR and LC-ESI-MS/MS techniques. Reaction rates with TRIS and TES are fast enough to compete with spontaneous hydrolysis in aqueous solution and to yield substantial amounts (up to 20-40%) of buffer adduct over the course of several hours. A reaction mechanism is proposed in which the amino function of the buffer serves as an intramolecular proton acceptor rendering the buffer hydroxyl groups nucleophilic enough for attack on the phosphorus atom of the agents. Results show that similar buffer adducts are formed with a range of hydroxyl and amino function containing buffers including TES, BES, TRIS, BIS-TRIS, BIS-TRIS propane, Tricine, Bicine, HEPES and triethanol amine. It is recommended to use alternative buffers like MOPS, MES and CHES when working with G-type nerve agents especially at higher concentrations and over prolonged times.

Eine neue Veröffentlichung in der Zeitschrift Analytical and Bioanalytical Chemistry beschreibt die Anwendung von 1H-31P HSQC NMR-Spektroskopie zur Verfolgung des Abbaus von hochtoxischen Organophosphorverbindungen durch das Enzym DFPase. Die Methode eignet sich für Methylphosphonate zu denen die Nerkenkampfstoffe Sarin (GB), Soman (GD), Cyclosarin (GF) aber auch VX gehören. Die Bestimmungsgrenze der Methode liegt bei ca. 100 μM bei Verwendung eines 400 MHz NMR-Spektrometers. Die Arbeit beruht auf vorgegangenen Arbeiten von Koskela et al. (Koskela et al., Anal. Chem. 2007; 79:9098-9106), die die Methode zum Nachweis von Kampfstoffen und Hydrolyseprodukten in komplexen Dekontaminationslösungen verwendet haben. Wir konnten nun zeigen, dass das Verfahren nicht nur für den statischen Fall, sondern auch für die dynamische Reaktionsverfolgung geeignet ist.

Von besonderem Interesse ist die Methode für die Reaktionsverfolgung in komplexen Medien. So konnte am Beispiel in bi-kontinuierlichen Mikroemulsion auf der Basis von Biodiesel gezeigt werden, dass auch in mehrphasigen Systemen eine Verfolgung der Reaktion möglich ist. Andere Verfahren wie z.B. die pH-stat Titration oder fluoridsensititive Elektroden versagen hier gewöhnlich.

Monitoring the hydrolysis of toxic organophosphonate nerve agents in aqueous buffer and in bicontinuous microemulsions by use of disopropyl fluorophosphatase (DFPase) with 1H-31P HSQC NMR spectroscopy.
Gäb J, Melzer M, Kehe K, Wellert S, Hellweg T, Blum MM.
Anal. Bioanal. Chem. 2009;396(3):1213-1221.
http://dx.doi.org/10.1007/s00216-009-3299-2

Abstract:
The enzyme diisopropyl fluorophosphatase (DFPase, EC 3.1.8.2) from the squid Loligo vulgaris effectively catalyzes the hydrolysis of diisopropyl fluorophosphate (DFP) and a number of organophosphorus nerve agents, including sarin, soman, cyclosarin, and tabun. Until now, determination of kinetic data has been achieved by use of techniques such as pH-stat titration, ion-selective electrodes, and a recently introduced method based on in situ Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy. We report the use of 1D 1H-31P HSQC NMR spectroscopy as a new method for real-time quantification of the hydrolysis of toxic organophosphonates by DFPase. The method is demonstrated for the agents sarin (GB), soman (GD), and cyclosarin (GD) but can also be used for V-type nerve agents, for example VX. Besides buffered aqueous solutions the method was used to determine enzymatic activities in a biodiesel-based bicontinuous microemulsion that serves as an example of complex decontamination media, for which other established techniques often fail. The method is non-invasive and requires only limited manual handling of small volumes of liquid (700 μl), which adds to work safety when handling highly toxic organophosphorus compounds. Limits of detection are slightly below 100 μM on a 400 MHz spectrometer with 16 FIDs added for a single time frame. The method is not restricted to DFPase but can be used with other phosphotriesterases, for example paraxonase (PON), and even reactive chemicals, for example oximes and other nucleophiles, as long as the reaction components are compatible with the NMR experiment.

Das Enzyme Diisopropyl Fluorophosphatase (DFPase) katalysiert die Hydrolyse nicht nur von Diisopropyl Fluorophosphat (DFP) sondern auch von einer Reihe hochtoxischer Nervenkampfstoffe der sog. G-Reihe. Zu diesen Kampstoffen gehören Tabun (GA), Sarin (GB), Soman (GD) und Cyclosarin (GF). Während DFP keinerlei Stereozentren enthält weisen alle genannten G-Kampfstoffe vier unterschiedliche Gruppen am Phosphoratom auf. Daher ist dieses Phosphoratom asymmetrisch und ein Stereozentrum. GA, GB und GF sind daher chiral und liegen als Enantiomerenpaare vor, die sich zu einander wie linke und rechte Hand verhalten (bei GD sind die Verhältnisse noch etwas komplizierter, da es ein weiteres Stereozentrum in einer Seitenkette gibt).

Bei chemischen Reaktionen wie der wässrigen Hydrolyse in alkalischen Lösungen unterscheiden sich diese Enantiomeren nicht, aber bei der Interaktion mit ebenfalls chiralen Molekülen wie z.B. Proteinen zeigen sie unterschiedliche Eigenschaften. Dies zeigt sich bei der Hemmung des Enzyms Acteylcholinesterase (AChE), dem “Hauptangriffsort” der Kampfstoffe. Hier zeigt ein Enantiomere eine deutlich stärkere Hemmwirkung, während das andere nur mäßig oder praktisch gar nicht hemmt. Bei der katalytischen Hydrolyse durch DFPase zeigt sich ebenfalls so ein Effekt. Der Wildtyp der DFPase baut vorzugsweise das weniger giftige Stereoisomer ab. Dies ist insbesondere bei medizinischen Anwendungen (in vivo oder auf der Haut) nachteilig, da es hier um eine möglichst schnelle Reduzierung der Toxizität geht. Die gezielte Veränderung der DFPase durch Mutagenese ist dabei eine mögliche Strategie zur Umkehrung der Enantioselektivität.

Model des Phosphoenzymintermediats der
DFPase für das Substrat Sarin

Aufgrund der Beschränkungen die bei der Verwendung hochtoxischer Stoffe gelten* war die Durchführung von evolutionärer Mutagense mit nachfolgendem Hochdurchsatz-Screening der erzeugten Mutantenbibiotheken kein gangbarer Weg. Daher entschieden wir uns für rationales Protein Design. Dabei ist anzumerken, dass die Umkehrung der Enantioselektivität eines Enzyms keine triviale Aufgabe ist und die Zahl der bisher zu diesem Thema veröffentlichten Arbeiten überschaubar ist. Bei der Konstruktion der Mutanten war es allerdings möglich, sich auf umfassende Kenntnisse zur Struktur des Enzyms und zumReaktionsmechanismus zu stützen, der über ein Phosphoenzymintermediat verläuft.

Es gelang schließlich Mutanten zu generieren, die die gewünschte Umkehrung der Enantioselektivität zeigen. Diese Umkehrung ging dabei nicht zu Lasten der Enzymaktivität. Vielmehr zeigen die Mutanten höhere spezifische Aktivitäten als der Wildtyp. Eine optimale Kombination aus Selektivität, Aktivität und Substrataffinität wird durch Mischungen von Wildtyp und Mutante erreicht. Hier konnten selbst bei niedrigen Substratkonzentrationen die Reaktionszeiten für die vollständige Hydrolyse beider Enantiomere um das vierfache verkürzt werden, wobei es zu einem stark beschleunigten Abfall der Toxizität kommt, da in der ersten Phase der Umsetzung bevorzug das giftige Stereoisomer abgebaut wird.

Die Strukturen der Mutanten wurde in der PDB unter den Zugangscodes 3HLI und 3HLH hinterlegt.

* Die Arbeiten mit Nervenkampfstoffen wurden in Übereinstimmung mit den Regeln des Chemiewaffenübereinkommens in Kooperation mit dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr durchgeführt.

Reversed Enantioselectivity of Diisopropyl Fluorophosphatase against Organophosphorus Nerve Agents by Rational Design.
Melzer M, Chen JC, Heidenreich A, Gäb J, Koller M, Kehe K, Blum MM.
J. Am. Chem. Soc. 2009;131(47):17226-17232.
http://dx.doi.org/10.1021/ja905444g

Research Highlight in Nature Chemistry:
Nature Chem. 2010;2(1):4-5.
http://dx.doi.org/110.1038/nchem.487

Abstract:
Diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from Loligo vulgaris is an efficient and robust biocatalyst for the hydrolysis of a range of highly toxic organophosphorus compounds including the nerve agents sarin, soman, and cyclosarin. In contrast to the substrate diisopropyl fluorophosphate (DFP) the nerve agents possess an asymmetric phosphorus atom, which leads to pairs of enantiomers that display markedly different toxicities. Wild-type DFPase prefers the less toxic stereoisomers of the substrates which leads to slower detoxification despite rapid hydrolysis. Enzyme engineering efforts based on rational design yielded two quadruple enzyme mutants with reversed enantioselectivity and overall enhanced activity against tested nerve agents. The reversed stereochemical preference is explained through modeling studies and the crystal structures of the two mutants. Using the engineered mutants in combination with wild-type DFPase leads to significantly enhanced activity and detoxification, which is especially important for personal decontamination. Our findings may also be of relevance for the structurally related enzyme human paraoxonase (PON), which is of considerable interest as a potential catalytic in vivo scavenger in case of organophosphorus poisoning.